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追踪5-hmC 揭开甲基化在表观遗传学的作用

核心提示:核苷酸掺入的实时记录,不仅产生了序列读取,还带来了关于聚合酶动力学的宝贵信息。通过这些信息,研究人员能鉴别DNA碱基的修饰。一般来说,聚合酶在修饰碱基周围的速率要比未修饰DNA慢。PacBio将其比喻为路上的减速带,通过减速带时,汽车要慢下来,聚合酶也一样。

【中国生物产业网(http://www.cnbioindustry.cn)】5月25日讯

核苷酸掺入的实时记录,不仅产生了序列读取,还带来了关于聚合酶动力学的宝贵信息。通过这些信息,研究人员能鉴别DNA碱基的修饰。一般来说,聚合酶在修饰碱基周围的速率要比未修饰DNA慢。PacBio将其比喻为路上的减速带,通过减速带时,汽车要慢下来,聚合酶也一样。

通过比较每个模板位点的掺入时间、脉冲间持续时间(IPD),可定量比较这一差异。利用这一方法,研究人员可直接检测DNA甲基化,包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。聚合酶动力学的测定是SMRT测序的内在组成,不会对DNA一级序列的测定有任何不良影响。

在测序之前,研究人员还采用了定向富集技术,让修饰检测更为可靠。富集原理同Active Motif的Hydroxymethyl Collector™试剂盒。首先利用β-葡萄糖苷转移酶将叠氮-葡萄糖转移到5-hmC上,产生N3-5-gmC。之后通过点击化学(click chemistry)反应安装一个生物素标签,再利用链霉亲和素磁珠选择性捕获包含5-hmC的DNA片段。之后一个简单的DTT处理就能释放结合的DNA片段,这样5-hmC就修饰成为HS-N3-5-gmC。即使只有一个5-hmC,DNA片段的pulldown产量也约为50%。此外,研究人员通过紫外吸收测定,这种方法是5-hmC特异的,包含5-mC的片段未被pulldown。生物通www.ebiotrade.com

通过这种方法,研究人员富集了基因组中的5-hmC,减少所需的测序量。此外,5-hmC上的大体积标签在SMRT测序中产生了更大的动力学信号,以便在较低覆盖度时更自信地确定修饰碱基。

表观遗传学的研究人员也正在积极开发各种新兴技术,来实现5-hmC的更准确、更灵敏检测。波士顿儿童医院等机构的研究人员开发出两种方法,来分析小鼠胚胎干细胞中5-hmC的基因组定位5。

第一种方法称为GLIB。GLIB是糖基化、高碘酸氧化和生物素化的缩写。它主要利用一些酶和化学反应的组合来分离出包含单个5-hmC的DNA片段。首先利用T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶(BGT)在每个5-hmC上添加一个葡萄糖分子,然后用高碘酸钠氧化葡萄糖,它将邻近的羟基转化成醛基,之后用醛基反应性探针进一步修饰,在每个5-hmC上添加两个生物素分子,并利用链霉亲和素来pull down。

第二种方法是通过亚硫酸氢钠处理基因组DNA,将5-hmC转换成5-亚甲基磺酸胞嘧啶(CMS),然后利用CMS特异的抗血清将包含CMS的DNA免疫沉淀。

之后,研究人员对小鼠胚胎干细胞中包含5-hmC的片段进行高通量测序。对于GLIB处理的DNA,他们使用了Helicos单分子DNA测序,这种方法不需要扩增步骤,从而避免了PCR偏向。对于CMS富集的基因组DNA,他们使用了Illumina测序仪,其较长的读长适合亚硫酸氢盐处理的DNA与基因组的高效比对。

而上个月的《Science》杂志也报道了一种新方法6。亚硫酸氢盐测序是发现基因组中5mC的标准方法,但它无法区分5mC和5hmC。因此,剑桥大学的化学家Shankar Balasubramanian及其同事在寻找一些化学反应,希望能改变其中一个核苷酸,让它们在测序中以不同的形式读取。

他们将双链DNA暴露在高钌酸钾(KRuO4)中,通过氧化反应在5hmC上添加了一个氧原子,这导致其转化成另一个修饰的核苷酸——5-甲氧基胞嘧啶(5fC),接着开展亚硫酸氢盐测序。在亚硫酸氢盐转化时,这种新的核苷酸(5fC)转化成尿嘧啶。而额外的氧化步骤对5mC无影响,这样研究人员就能区分基因组中这两种核苷酸。

之后,研究小组利用氧化过程来靶定小鼠胚胎干细胞的基因组DNA中的5hmC。利用氧化和亚硫酸氢盐测序过程,他们高度精确地定位了5hmC。将此结果与标准亚硫酸氢盐测序的数据进行比较,研究人员确定了5hmC和5mC的精确位置。

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编辑:sunny

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