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基因治疗促进脊柱融合

核心提示:

 【中国生物产业网(http://bio.easysources.cn/)】10月31日讯  

    脊柱先天性畸形、退变、获得性不稳以及脊柱肿瘤等疾患治疗后脊柱稳定性的重建都需要通过骨移植来促进脊柱融合。美国临床统计数据表明每年超过25万例的脊柱融合手术多数需要骨移植来促进脊柱融合,中国虽然没有确切的统计数据,但就人口比例来说,实际情况可能超过美国。虽然自体骨移植仍然是促进脊柱融合的金标准,但仍然有5-35%的单节段脊柱融合患者发生骨不融合,而多节段脊柱融合的骨不连发生率则更高[1]。此外,自体骨、异体骨以及生物替代材料移植仍存在诸多难以解决的问题。因此,临床亟需进一步研究骨再生的生物学机制以寻求更好的促进脊柱融合的方法[2]。应用局部基因治疗技术可在脊柱特定的解剖区域释放成骨递质以刺激新骨的形成从而最大程度地促进脊柱融合,该方法是一种较有希望替代传统自体骨移植的新型治疗技术。本文拟就近年来基因治疗促进脊柱融合的相关研究进展做一综述。
 
    基因治疗促进脊柱融合研究的应用前景
    脊柱融合不同于四肢长骨骨折的骨愈合:1)不是重建原有的解剖结构,而是通过重建合理的脊柱机械力学结构来改变因脊柱侧弯、滑脱、肿瘤、感染和创伤所致的脊柱病理解剖变化。2)脊柱后外侧横突间融合具有独特的局部微环境:横突细小,去皮质后对移植物的血液供应小,特别是移植物的中央部位,需要血管再化生;横突间融合是在椎体旁肌肉间的大段异位成骨,其融合的机制和所受的力学环境不同于四肢骨移植的正位骨修复[3]。近年来,涉及生命科学和工程学的骨组织工程学技术已成为骨修复重建领域的重要研究热点。在脊柱融合的临床实验研究中,需要在后外侧横突间植入高达毫克级的重组人骨形态发生蛋白(rhBMPs)才能有效地促进脊柱融合以克服外源蛋白应用易流失、半衰期短和效率低等缺点。但是,超生理剂量的rhBMPs临床应用存在费用昂贵、长期生理影响不确定等缺点而难以在临床进一步应用。目前,在基因治疗研究策略已经调整为重点治疗非致死性疾病的背景下,利用现有技术,基因治疗最有希望在骨科领域的临床组织修复(如骨愈合等)上取得成功[4、5]。就具有挑战性的临床脊柱融合而言,基因治疗适合用于脊柱融合的治疗[3]:(1)骨愈合过程高度保守,目前对此研究较为深入,而BMP作为一种有效的成骨基因其疗效得以肯定。(2)不同于慢性疾病的治疗,骨愈合通常在几周内完成,此过程并不需要外源基因长期、高效表达。通过选择特定的基因导入载体可控制治疗基因的表达,从而避免过多的新骨生成以影响机体功能。(3)通过局部基因治疗方法,可选择特定的种子细胞,并通过这些基因修饰的细胞将治疗基因导入四肢骨折或脊柱的特定解剖部位,从而可避免全身应用的并发症,其技术要求相对简单。(4)前期动物实验结果较为满意。
基因治疗促进脊柱融合的策略和方法
    2.1 腺病毒介导的BMPs基因治疗促进脊柱融合
    基因导入系统是基因治疗的核心技术,可分为病毒类和非病毒类载体系统,其中,腺病毒载体因具有高效转染、易于应用并能产生高水平的基因表达产物等诸多优点而在实验和临床前期研究中得到充分应用。Riew等[6、7]利用重组BMP2的腺病毒(AdBMP2)体外转染兔自体骨髓间充质干细胞(BMSC),随后将细胞和胶原载体复合后植入兔L5-6后外侧横突间,结果发现5只实验动物中只有1只产生脊柱融合。该研究小组随后将AdBMP2体外转染BMSC的时间由原来的1天提高到7天,发现所有实验动物都获得了满意的脊柱融合效果。Riew等[8]在此基础上进一步利用AdBMP2体外转染猪BMSC后,通过微创胸腔镜技术将BMP2基因修饰的猪自体BMSC细胞植入胸椎间盘中,6周后证实实验组6个胸椎体间都获得满意的前路融合效果。 Wang等[9]则比较了BMP2基因修饰的鼠BMSC细胞和自体骨在鼠单节段脊柱后外侧横突间融合的疗效,结果发现通过局部基因治疗方法在横突间产生了大量的近似正常的小粱样骨,而自体骨融合样本的组织学则显示为薄、花边样小粱骨。据此,作者认为基因治疗疗效优于自体骨。Hidaka等[10]利用AdBMP7转染体外扩增培养4周的骨髓细胞并种植到异体骨传导支架上构建人工骨材料,随后将该材料移植到裸鼠脊柱后外侧,术后8周的影像和机械力学资料显示脊柱融合率分别达到70%和80%。但是该研究方案涉及冗长费时的细胞培养程序,并不适合临床应用。Helm[11、12]领导的研究组则尝试更为简便的方法促进脊柱融合:将一定量的AdBMP2或AdBMP9经皮直接注射到裸鼠的腰骶椎旁肌肉中,随后的CT影像学和组织学证实动物获得了满意的脊柱融合。
    2.2  腺病毒介导的LMP-1矿化蛋白(LMP-1)基因治疗促进脊柱融合的实验研究

 

    BMP类分泌性骨诱导因子在高等动物脊柱融合的实际应用中存在着一些缺陷[3]:1)高达毫克级的超生理剂量BMP蛋白才能有效促进脊柱融合且BMP蛋白在体内难以维持有效的生理浓度;2)BMP作为分泌性骨诱导蛋白只是复杂成骨途径中多因子相互作用环节中的一员,因此单独应用BMP诱导成骨不能完全模拟脊柱融合过程中内在的分子作用机制。3)高剂量BMP体内应用的生理副作用有待进一步的观察。基于此,Boden等[3、13、14]利用差异PCR显示技术,成功地克隆了一种新的细胞内信号分子--LMP-1(矿化蛋白-1,LIM minialize protein),该分子表达于成骨细胞分化前数小时,可诱导转染LMP-1基因的靶细胞内BMP2、4、6、7等多种BMP分子及其它生长因子的表达。因此,作为一种胞内信号分子,仅需要少量细胞表达即可发挥级联放大的成骨效应,提高成骨效率。作者认为LMP-1作为成骨早期细胞内信号分子可以克服BMP类分泌因子的缺陷从而能按生理形式完整模拟骨生成的过程。因LMP-1高效诱导成骨,故在体内应用时不需要基因高效转染和表达。Boden等[3]以脂质体为基因转移载体,发现转染了LMP-1基因的大鼠骨髓细胞和脱钙骨基质复合后所构建的人工骨能有效地促进裸鼠胸、腰脊柱融合。虽然该研究中作为基因转移载体的脂质体在体外的转染效率仅为1%,但实验仍然获得了良好的成骨效果。随后,他们发现重组LMP-1的腺病毒(AdLMP-1)在体外转染成骨前驱细胞时只需要很低的感染复数(MOI=O.25pfu/cell),和其他以腺病毒为基因转移载体的基因治疗相比低几个数量级[3]。在兔脊柱融合研究中,该研究组证实AdLMP-1(MOI=0.25-0.4pfu/cell)体外转染兔骨髓或周围血细胞后种植于脱钙骨基质或胶原-陶瓷复合体后能有效地诱导兔腰椎后外侧横突间的融合[15]。因此这种低剂量腺病毒体外转染的治疗模式可以最大限度地避免转染后移植到体内的细胞被机体免疫系统识别清除,有较强的临床适用性。Boden等[16]进一步探索上述实验成果应用于临床的可行性,考虑到既往感染过腺病毒的人群在接受治疗时体内的腺病毒中和抗体可能会影响AdLMP-1的临床疗效,他们将兔预先注射Ad5型腺病毒后复制预先感染腺病毒的兔动物模型, 4或16周后,在移植自体LMP-1基因修饰的周围血细胞细胞促进兔脊柱融合实验时,通过增加病毒感染剂量或受感染的细胞数目(MOI=10pfu/cell、1×107细胞),以及增加病毒感染的时间(30分钟)来克服机体体液免疫排斥反应,达到了满意的脊柱融合效果。
    2.3 裸质粒介导的BMP7基因治疗促进脊柱融合的研究
    为避免病毒类载体体内应用可能产生的毒性、免疫反应等副作用,部分学者尝试应用非病毒基因转移载体促进脊柱融合。Bright等[17]通过经皮穿刺和开放手术方法,将25mg或500mg编码BMP7基因的裸质粒和胶原载体复合物植入SD大鼠L5-6后外侧横突间肌肉中,术后2、4周通过组织学检查发现上述方法能成功地诱导肌肉内异位成骨,但没有产生脊柱融合。作者认为可能是所构建的裸质粒和胶原复合物在动物肌肉中所产生的BMP7蛋白总量不足以成功诱导脊柱融合。作者进一步的实验将通过改进裸质粒的结构和优化载体、或者通过肌肉内电转移方法来促进BMP7蛋白的生成,希望能通过这种副作用小的非病毒基因治疗方法能有效促进脊柱融合。
    2.4  核转染法介导的非病毒BMP6基因治疗促进脊柱融合的研究
常规的磷酸钙沉淀、脂质体和电穿孔方法介导的非病毒基因转染的效率较低,且对细胞的毒性较大,难以在临床应用。为克服非病毒基因转染的低效率这一技术瓶颈,德国Amaxa生物技术公司(www.amaxa.com)新近推出的综合电穿孔和脂质体技术的新型非病毒基因转染法—核转染法(nucleofection)。该方法根据不同类型的细胞,通过优化电转移参数和转移液而使靶质粒DNA直接进入细胞核内,从而快速进行转染基因表达。Sheyn等[18]分离培养猪脂肪来源的间充质干细胞后,在体外通过核转染法将BMP6质粒转入细胞中,检测体外外源基因的转染和表达效率。随后作者将这些转基因细胞注射入裸鼠的椎旁肌肉中。研究表明核转染法能有效介导BMP6基因的转染,同时能诱导裸鼠的脊柱融合,且副反应小。
    2.5 商品化BMPs促进脊柱融合的研究
     在多种动物脊柱融合模型中, 应用基因重组技术生产的BMPs取得了满意的融合效果, 为其过渡到临床应用打下基础。Boden等[19]将载有BMP2和可吸收胶原复合物的Cage 通过前入路植入11名患者的腰椎间, 术后2年随访发现所有患者都获得了满意的脊柱融合。临床上,需要高达毫克级商品化BMPs才能有效促进脊柱融合,而高昂的费用限制了其临床应用。
 
    3 基因治疗促进脊柱融合的安全性研究
尽管基因治疗促进脊柱融合的动物实验结果较为理想,但是,在临床应用时尚需解决诸多问题,如病毒载体的安全性及治疗基因表达的可控性、种子细胞的优化、支架载体的选择以及多基因联合治疗的问题。而这其中,基因治疗的安全性是首先需要考虑的问题。
    3.1病毒载体的安全性和治疗基因表达的可控性:
通过去除病毒载体所有的病毒基因而只保留其复制和包装所必须的顺式作用元件是病毒载体发展的方向。这种策略可以最大限度地扩大载体的容量和减少病毒蛋白表达所引发的免疫毒性。腺病毒基因组中的早期基因表达产物是导致体内腺病毒应用部位细胞和体液反应的根本原因,这种免疫排斥反应可导致治疗基因表达水平的下降。虽然将基因修饰后的种子细胞注入体内可以避免机体直接接触病毒而产生免疫排斥,但研究表明在某些情况下,感染腺病毒的细胞所表达的腺病毒早期基因产物可能逸漏出细胞而造成免疫排斥反应[20]。因此,生产大部分病毒基因删除的无内脏的腺病毒是腺病毒载体未来应用的一种趋势,其尚未在骨愈合研究领域得以应用。而腺相关病毒(AAV)载体在构建时删除了病毒基因组所有组件而只保留了两端的长末端重复序列,因此该载体体内应用时免疫原性低。 Chen等[21、22]将一定量重组BMP2和BMP4的腺相关病毒(AAVBMP2、AAVBMP4)直接注射到免疫功能正常的大鼠后肢肌肉中,发现能诱导肌肉内异位成骨且注射局部没有免疫炎症反应。 与AAV载体相反,在免疫功能正常的大鼠中,需要在肌肉注射AdBMP2前24小时给予一定剂量的免疫抑制剂以暂时抑制机体的免疫反应才可以观察到有明显的成骨[23]。Chen等[21]推测在免疫功能正常的机体中,利用微创技术将AAVBMP2/4载体多点注射到需要融合节段的脊柱后外侧横突间肌肉中,有望达到满意的脊柱融合效果。
     治疗基因的高效表达并不是基因治疗时的唯一要求,如果进入体内的基因处于无调控状态将会对机体产生灾难性后果,最佳的方法是能够有序控制基因的时空表达。尽管基因治疗促进脊柱融合的动物实验结果较为理想,对于以干细胞为种子细胞的基因治疗来说,在未来临床应用时,通过严谨调控外源基因的表达时间、持续过程和表达产量而调节治疗基因的表达显得尤为重要,因为骨愈合通常在几周内完成,此过程并不需要BMP等外源基因长期、高效表达。BMP长期、高效表达后过多的新骨生成会造成脊柱融合临近部位的神经根和脊髓不必要的受压;此外,BMP具有多重生理作用,过多的、超过治疗窗口浓度的BMP所引发潜在的全身副作用不容低估。随着安全、无毒、触发式可诱导在转录水平严谨调控基因表达的载体研制成功,为基因治疗进入临床应用提供了有力的工具。新一代四环素调控的基因表达系统(Tet-on/off)有效地解决了诱导物毒性作用、基线逸漏和低水平表达等问题,是最常用的一种基因表达调控系统,适合于未来临床的应用[24]。Gazit[25]等将四环素调控BMP2表达的质粒ptTATop-BMP2(Tet-off)转染C3H10T1/2细胞并筛选稳定表达BMP2的细胞克隆,将细胞和胶原海绵复合后用于修复小鼠的桡骨骨缺损。 实验首次证实四环素衍生物强力霉素(DOX)可调控小鼠体内BMP2的表达并能有效修复桡骨骨缺损。该研究小组新近将2×106个上述细胞直接注射到C3H/HeN鼠的L2-L6椎旁肌肉中,在手术后3、7和30天分别在动物饮水中添加DOX以终止BMP2的表达从而判断脊柱融合所需要的BMP2表达最短时间窗口。结果表明实验组动物4周后即能在脊柱后外侧形成新骨,而8周后可形成更为成熟的板层骨从而达到坚强的脊柱融合[1]。更为重要的是,实验证明在该脊柱融合实验模型中BMP2最短表达时间窗口为7天就足以诱导新骨形成以促进脊柱融合,从而第一次在探讨BMP2时空表达和新骨形成的关系上做出了有益的探索。此外,该实验同时表明在脊柱融合临近部位没有局部以及全身毒副作用。作者推测以可调控的BMP基因修饰的间充质干细胞为种子细胞的基因治疗可能是未来临床促进脊柱融合的有效手段。Gazit等[26]进一步构建了四环素正性调控(Tet-on)的AAVBMP2载体,直接注射到小鼠颅骨缺损处和椎体旁肌肉中亦能有效地修复颅骨缺损和促进脊柱融合。作者将进一步深入研究DOX和新骨生成之间的剂量—骨生成反应曲线,以便最大限度地模拟自然骨生成模式和精确调控骨形成。
    3.2   商品化BMPs促进脊柱融合的安全性研究

 

临床上, 椎板切除减压后常需要同时行后外侧横突间、前路椎体间或后路椎体间植骨融合。所以, 应用BMPs后如果新骨过多形成, 则有可能导致脊柱融合节段以远部位不必要的融合、硬膜外新骨生成导致脊髓压迫及椎间孔狭窄。 Martin 等[27]将17只恒猴腰椎板切除后应用BMP2行腰椎后外侧融合, 结果发现在椎板切除部位只有反应性骨形成, 而没有过多的新骨生成压迫脊髓。在随后的实验中, Boden 等[28]将BMP2和不同载体复合后植入24只腰椎板切除后的恒猴后外侧横突间, 结果椎板切除后暴露的硬膜上没有骨生成。 已有的研究结果证实BMPs促进脊柱融合是安全有效的。
    4.  基因治疗促进脊柱融合的动物实验原则。
基因治疗促进脊柱融合进入临床实验前必须进行严格规范的动物实验,且动物实验必须遵循从低等到高等动物的原则[13、29]。因动物和人类体内生理和力学解剖环境有所不同,在动物实验中所获得的实验数据推断到人的临床应用中必须谨慎,在动物骨折愈合和脊柱融合实验中获得成功的基因治疗方案不一定在人类临床实验中获得成功。但是,反之,在低等动物实验中不成功的方案必然在更复杂的人体环境中难以取得成功。因此,在低等动物中获得成功的基因治疗促进骨愈合或脊柱融合的方法需要在非人灵长目动物实验中获得成功后方能进入临床实验,最终可以过度到人的临床应用中。目前基因治疗促进脊柱融合的实验研究仍局限于小动物实验研究,且多为单一的脊柱后外侧横突间融合模式,进一步深入研究需以非人灵长目动物为实验对象,进行外侧横突间和椎体间融合实验研究,以求更接近临床实际。
    5.     结束语
大量临床前期研究数据清楚表明局部基因治疗技术可应用于人类疾病治疗,但针对需要接受骨修复治疗的患者而言,自体骨移植仍然是目前临床常规治疗方法。一般而言,基因治疗技术并不是对所有患者来说都是必须的。但是,对于难治性骨修复而言,该技术提供了一种新的治疗途径。此外,当应用基因治疗策略治疗上述疾病时,研究者必须考虑到这些新的分子治疗方法是能够用来改善患者的生活质量,而不是用来治疗致死性的疾病。因此,首先要考虑这种治疗的安全性。动物实验研究中较理想的腺病毒载体在未来临床应用中必须进一步加以改进以确保其应用时有极大程度的生物安全性。随着安全、高效并能实现治疗基因精确调控的基因治疗技术进一步完善,基因治疗技术有望替代临床常规自体骨移植而成为促进脊柱融合的常规手段。
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